Pozadinska priča još nije do kraja otkrivena, ali je potvrđeno da je Ezio pripadnik plemićke porodice te da su mu roditelji i nekoliko rođaka ubijeni. Ubisoft ovo navodi kao glavni razlog zbog kojeg je mladi bogataš iz plemića prešao u klan ubica te da se planira osvetiti svima koji su mu uništili život. Kao i Altair i Ezio je predak barmena iz sadašnjosti kojeg je zarobila kompanija Abstergo zbog brojnih eksperimenata. Lik Lucy Stillman takođe igra važnu ulogu u igri, ali se još ne zna o kakvoj se ulozi radi. Radnja igre se odvija 1486 godine u Italiji u periodu renesanse, 295 godina nakon radnje iz prvog dela. Assassin's Creed II uključuje poznate istorijske ličnosti kao što su Leonardo da Vinci, Niccolò Machiavelli, Caterina Sforza i Lorenzo de' Medici. Kao neke od lokacija u kojima se igra odvija navedeni su Venecija, Firenca i Rim. Neke od najznačajnijih mesta u igri su svakako Bazilika Svetog Marka, Veliki i Mali Kanal kao i Rialto most.

Napredovanjem kroz igru igrači će biti u mogućnosti da iskušaju leteću mašinu koju je konstruisao Leonardo da Vinci, a ova letelica će imati namenu sredstva za bekstvo nakon zadatka ili kao transportno sredstvo do određene lokacije. Pored ovoga igra će sadržati mnoštvo novih glavnih misija kao i sporednih mini igara koje su interesante i služe kao razbibriga između glavnih zadataka.

Pored novina u mogućnostima kretanja i zanimljivih misija u igru će biti implementirano i novo oružje kao što su sekire, krampovi, mačevi, noževi, samostreli i sl. Set od šest dodatnih komada oružja će biti ekskluziva na PlayStation 3 konzoli. Treba naglasiti da će postojati mogućnost uzimanja naoružanja od protivnika koje će se moći koristiti u borbama protiv njih. Za razliku od prethodnika, najavljen je znatno sofisticiraniji sistem borbe. Igrači će morati koristiti različite strategije za različite protivnike, a Ezio će sa svojim skrivenim mačevima moći usmrtiti dva protivnika odjednom. Ističe se i korišćenje dimnih petardi koje će se upotrebljavati da bi se zbunile velike grupe čuvara te da bi se omogućilo lakše bežanje sa mesta zločina.

Sistem skale zdravlja je modifikovan i samim time obezbeđuje dinamičniju akciju i zanimljivije iskustvo. Sećanje na prošlost, skala koja je korištena u prvom delu igre pomaže da se zdravlje regeneriše kada dođe blizu nule. Neke povrede će igrače odvesti kod nekog od brojnih lekara koji imaju svoje ordinacije na ulicima i koji će se pobrinuti da se Eziu vrlo brzo vrati sva neophodna snaga.

Trailer koji je premijerno prikazan na E3 sajmu pokazuje znatno unapređeni sistem mehanike kretanja po nepristupačnom terenu. Ezio će koristiti svoje mačeve da bi otvarao zaključana vrata, a noževe će bacati da bi eliminisao udaljene mete. Drugi veoma bitan element prikazan u trailer-u je to što više nema mesta koja su potpuno sigurna za skrivanje jer će čuvari Ezia tražiti po svim lokacijama područja na kojem se nalaze. Kao prednost glavni protagonista će pre svake misije moći usmrtiti čuvare te ih sakriti na mesta kao što su kanalizacije, kola sa senom i sl.